【建模文章解讀 】 采用系統定量毒理學評估因小分子化合物導致線粒體損傷和膽汁酸毒性，而出現肝毒性呈現種屬差異
原文作者
Grant Generaux1, Vinal V. Lakhani1, Yuching Yang1, Sashi Nadanaciva2, Luping Qiu3, Keith Riccardi4, Li Di4, Brett A. Howell1,, Scott Q. Siler1,, Paul B. Watkins5,6, Hugh A. Barton7, Michael D. Aleo3, Lisl K. M. Shoda1
1 美國DILIsym Services 公司
2 美國輝瑞制藥公司，全球藥物化學部
3 美國輝瑞制藥公司，藥物安全研究與開發部
4 美國輝瑞制藥公司，醫藥科學部
5 美國北卡羅來納大學教堂山分校，埃舍曼藥學院
6 美國北卡羅來納大學教堂山分校，藥物安全科學研究所
7 美國輝瑞制藥公司，生物醫學設計部
導 讀
FDA當前非常鼓勵制藥企業使用模型的方法評估在研化合物特性，以提高藥物的安全性。本次解讀的案例：采用定量毒理學軟件DILIsym重現了PF-04895162種屬差異性的肝毒性結果，解釋了化合物在人體產生肝毒性的原因。通過案例學習，可了解如何通過DILIsym定量評估肝損傷。
案例摘要
該案例說明如何采用DILIsym軟件(一款評估肝損傷的定量毒理學計算工具)重現PF-04895162 (ICA-105665)導致的種屬差異性肝毒性。PF-04895162是開發用于治療癲癇癥的藥物，由于在健康志愿者中觀測到氨基轉移酶的升高而被迫終止(NCT01691274)，然而在臨床前安全性研究中并沒有發現肝臟安全性的問題。整合表征肝毒性機制以及預測體內肝臟暴露的體外數據到DILIsym軟件中，重現該化合物的臨床肝毒性與未在大鼠身上發現肝毒性的情況。從多重維度上模擬考察差異性，并發現人體肝臟暴露要高于大鼠。模擬結果提示人體肝毒性是因為化合物同時造成了線粒體毒性和膽汁酸轉運體的抑制(假設去除上述一項機理都可以使其肝損傷消除)。模型表明更高的PF-04895162肝臟暴露(比大鼠安全性試驗給藥劑量時的暴露更高)時，會加重線粒體損傷但依然不會導致大鼠肝毒性，這是因為該種屬不能有效地積累產生細胞毒素的膽汁酸。這些研究提示聯合體外數據和計算機篩選的方法可以鑒定潛在肝毒性的風險，并為類似的前瞻性研究奠定的基礎。
推薦理由
很多臨床前看上去很有前景的化合物，但由于臨床的安全性(包括肝臟毒性)問題而被終止。本案例聯合體外數據(表征肝毒性的機制性參數以及預測肝臟暴露的模型數據)和DILIsym軟件(定量評估肝損傷的模型軟件)，重現化合物PF-04895162種屬差異性的肝毒性結果，并解釋了該化合物在人體產生肝毒性的原因。通過研究工作，說明模型可以準確反映觀測結果，并為其它藥物的肝毒性評估工作奠定了基礎。此外，該工作也可用于詳細學習DILIsym的模型搭建、模型參數、結果分析等知識。
軟件用途
案例中，利用DILIsym軟件搭建PF-04895162肝損傷評估模型?？疾炝嘶衔镌诟闻K的暴露(通過生理藥代動力學PBPK模型進行預測)、可能產生肝毒性的一種或多種機理(多重維度進行分析確認)等相關因素重現PF-04895162種屬差異性的肝毒性結果。通過模型的開展，發現化合物同時造成了線粒體毒性和膽汁酸轉運體的抑制，進而產生了人體的肝毒性(去除其中一個機理都會使得肝毒性消除)；而大鼠由于不能有效累積膽汁酸，因此即使比安全性更高的肝臟暴露也僅加重線粒體的損失，但不會直接產生肝毒性。
1 研究背景
FDA提出創新監管科學計劃(ARSI)作為改善監管科學質量和效率的戰略計劃，此項戰略的一個方面便是開發計算方法和數學模型以提高藥品的安全性。DILIsym軟件應用定量系統毒理學(QST)方法評估藥物性肝損傷，現已成功用于解釋臨床肝信號的數據。此外，DILIsym還能重現大鼠與人肝毒性的種屬差異性。
PF-04895162 (ICA-105665，由Icagen公司發現)是開發用于治療癲癇病的全新小分子化合物。PF-04895162在多個臨床前種屬進行了安全性評估：大鼠給藥7天的毒性試驗中，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的水平呈現劑量的相關性，提示有潛在的肝毒性；然而并沒有檢測到肝損傷的組織學變化證據，且在7天給藥的重現研究中未再觀察到ALT的水平變化。大鼠28天和6個月的毒性試驗也未發現氨基轉移酶的水平變化和肝臟毒性；獼猴9個月的毒性研究結果也顯示陰性的肝毒性結果?？傊?，臨床前的研究未發現肝臟可能是該化合物安全性問題的靶器官。
在臨床研究中，健康志愿者單次給藥劑量爬坡至600 mg或多次給藥劑量爬坡至每天兩次給藥200 mg (BID, 共7天)均未發現有明顯數據(如ALT > 3x ULN)說明PF‐04895162會造成肝損傷。另外一個7天給藥的研究中，12個志愿者250 mg BID或300 mg BID給藥后發現一例ALT的升高。但意外的是，14天給藥的研究，8個志愿者300 mg BID給藥后有6例出現了ALT的升高，甚至高達5x正常值的上限(ULN)；這項研究也直接導致了該化合物開發計劃的中止。
因此本工作選擇PF‐04895162作為DILIsym軟件評估種屬差異性肝毒性的潛在案例，聯合肝毒性機制和預測體內暴露的體外數據至DILIsym中以預測肝毒性。特別測定了PF‐04895162與線粒體功能、化合物與膽汁酸轉運體相作用的體外數據；通過生理藥代動力學(PBPK)模型預測化合物在大鼠及人體內的暴露。模擬結果發現可以重現該化合物在臨床人群的肝毒性，但非臨床種屬無肝毒性的結果。此外，模擬發現人體肝毒性是由于該化合物同時導致了線粒體損傷和膽汁酸毒性，去除其中一個機理都不會使得ALT的升高。最后模型設置的劑量方案以及肝毒性的不確定性也均和臨床與動物觀測結果一致。該案例也說明了DILIsym軟件可以用于鑒定潛在的人體肝毒性風險。
2 建模數據與處理
2.1 體外表征肝毒性機制的實驗
為了機制性地模擬PF-04895162介導的肝損傷，收集了體外表征PF-04895162與線粒體毒性、膽汁酸轉運體、氧化應激相互關系的數據。當前研究所采用的數據來自先前的報道，且未觀察到PF-04895162會產生氧化應激。采用DILIsym的膽汁酸及線粒體子模型進行模擬，相關的毒性數據匯總如下：
膽汁酸轉運體毒性數據：通過標準的囊泡轉運實驗測定PF-04895162對人BSEP, MRP3和MRP4以及大鼠Bsep和Mrp3等轉運體的半數抑制濃度(IC50)；假如測定的抑制濃度達不到抑制50%，則外推曲線計算IC50；然后將測定或外推的數據直接用于DILIsym。如果不存在抑制常數(Ki)的數據，DILIsym通常的做法是選擇α=5以表征為混合的膽汁酸抑制特性。實驗結果發現PF-04895162對人或大鼠膽汁酸轉運體的作用具有濃度依賴性：PF-04895162抑制人外排轉運體MRP4、未能直接測到外排轉運體BSEP及 MRP3的IC50 (不能有效抑制)、也未能測到攝取轉運體NTCP的IC50；PF-04895162能夠抑制大鼠Mrp3及Bsep外排轉運體、對攝取轉運體Ntcp的IC50也外排轉運體相近。
線粒體毒性數據：為了表征潛在的大鼠及人線粒體毒性，將不同濃度的PF-04895162與大鼠及人肝細胞孵育24小時。實驗結果表明該化合物對基礎耗氧量(OCR)具有微弱的影響，24小時內OCR基本沒有下降；當加入羰基氰對三氟甲氧基苯腙(FCCP)后，發現化合物對肝細胞OCR的作用呈現劑量依賴性；這些結果提示化合物可能是線粒體電子傳遞鏈(ETC)的輕微抑制劑；為準確描述作用部位處化合物濃度與效應之間的關系，測定了化合物在肝細胞內的濃度，發現結果要遠高于理論的平均濃度。MITOsym模塊用于再處理所測定的Seahorse數據(也即體外測定的PF-04895162線粒體毒性的數據)，然后采用一個轉換因子將MITOym的參數轉為DILIsym的體內數據。
2.2 PBPK建模
采用DILIsym的PBPK子模型重現PF-04895162在大鼠及人觀測的血漿濃度-時間曲線。最為簡化的PBPK模型可以用于表征每個個體(人)的PK行為；由于口服給藥后存在腸道飽和吸收，因此需要采用稍微復雜些的PBPK模型表征大鼠的PK特性。大鼠PBPK子模型包含了血液、肝臟、肌肉、腸道和其它組織、人體的模型則僅包含了血液和肝臟兩個房室(剩余的器官則全部納入系統分布體積中)；兩個種屬的子模型，均采用血流限速型的組織。相關設置及優化的模型參數如下表所示：
2.3 模擬個體的基線值
個體模擬的基線值采用人體測量學及生物化學性質的平均值，再基于基線值優化大鼠及PBPK子模型。
2.4 Human SimCohorts
SimCohorts是比SimPops數據集稍少的虛擬個體(n = 16)，本工作選擇了Human_ROS_apap_mito_BA_v8A_1_Multi16_A SimCohort，包含了線粒體功能損傷、膽汁酸淤積、氧化應激等個體敏感的參數，并用于研究肝毒性的機理。模型開展多種方式的研究，如果整合PF-04895162所有的毒性機理、僅不存在線粒體功能損傷、僅不存在膽汁酸毒性等情況；當不存在某一項機理時，查看PF-04895162產生臨床個體ALT水平升高的情況，并分析對臨床肝毒性的貢獻。
2.5 SimPops
SimPops收集了反映人體測量學及生物化學等參數變異的虛擬個體。本工作所有人體的模擬是基于Human_ROS_apop_mito_BA_v8A_1 (n = 285) SimPops進行的，其中健康志愿者的體重、線粒體功能、半胱天冬酶的激活(細胞凋亡)、膽汁酸轉運體的表達、氧化應激等參數的群體分布見支持文件；大鼠的模擬則基于Rat_ROS_apop_mito_BA_v8A_11 (n = 294) SimPops進行的，相關模型參數的群體分布也見支持文件。
2.6 模擬方案
優化大鼠PBPK模型的模擬方案為：1 mg/kg IV或10, 30, or 100 mg/kg/day每天口服給藥一次至28天；優化人PBPK模型的給藥方案為：300 mg單次口服給藥，并使用300 mg每天口服給藥兩次(BID)測試了建立的模型。對于肝毒性研究，模擬了大鼠100 mg/kg/day口服給藥至28天；人則考察了300 mg BID口服給藥至14天，并緊接著一個14天的清洗期。人體還模擬了200 mg BID口服給藥至7天，以重現早期臨床研究中未發現肝毒性的結果。
2.7 多重線性回歸分析
為了更好地理解具體哪個機制參數對血漿ALT升高更有顯著意義，采用R進行了多重線性回歸分析。由于SimPops中不同參數的數量級處于一個較大的范圍內，所以將SimPops中的每個參數值除以其最大值進行歸一化處理，使得所有參數的范圍都落在0-1之間。
3 模型結果與分析
3.1 大鼠和人PBPK模型的優化
大鼠的PBPK模型是根據靜脈及口服給藥的觀測結果進行優化，優化過程中直接使用了實驗值或者考察一定范圍內變化的影響，最終得到的血漿濃度-時間曲線和觀測結果較為一致，如下圖所示：
人體PBPK子模型也根據口服給藥300 mg后的血藥濃度-時間數據進行優化，優化后的模型結果也可以和單次及14天多次給藥的結果吻合一致，如下圖所示：
此外，還進一步得到了大鼠及人肝臟平均的濃度-時間曲線，如下圖。模擬的大鼠肝臟與全血濃度比與大體體內定量全身放射自顯影技術(QWBA)的數據進行了對比，以確定模擬的肝臟濃度與測定數據一致。當然，沒有獲得相應人體肝臟的濃度數據，因此預測的肝臟濃度與體外肝細胞實驗測定細胞內濃度進行了對比。
3.2 大鼠肝毒性的模擬
按照制定的模擬方案，整合大鼠PBPK子模型以及兩個推測的毒性機理(線粒體損傷及膽汁酸轉運體抑制)進行了大鼠的群體模擬，模擬結果發現與臨床前結果一致，未發現PF‐04895162具有肝毒性，如下圖4 (評估藥物誘導嚴重肝毒性, eDISH，該圖是典型地評估化合物臨床肝臟安全性的方式)。還進一步研究了膽汁酸和ATP的動力學變化，發現肝毒性的膽汁酸鵝去氧膽酸-氨基化合物(CDCA-amide)的水平未發生較大影響、肝臟ATP的水平僅有輕微的下降，如下圖5。
3.3 人體肝毒性的模擬
人體模擬的eDISH圖顯示PF‐04895162對人具有肝毒性。人體SimPops的預測結果：ALT > 1x ULN的比例為21% (59/285), ALT > 5x ULN的比例為11% (32/285), ALT > 10x ULN的比例為6% (18/285); 膽紅素上升并超出2x ULN的比例為3% (9/285)；而臨床觀測的結果為：ALT > 1x ULN的比例為75% (6/8), ALT > 5x ULN的比例為12% (1/8), ALT > 10x ULN的比例為0% (0/8)；此外也觀測到兩例受試者的總膽紅素水平介于1 x 和2x ULN。因此當前大鼠與人體的肝毒性模擬結果與觀測數值基本吻合；和I期多劑量給藥的少數受試者結果相比，模擬的結果在ALT輕微變化階段的比例要少一些，另外嚴重肝損傷的比例要高一些。
模擬發現有9例個體(9/285, 3%)將發生嚴重的肝損傷(ALT > 3x ULN, total bilirubin > 2x ULN)，這個模擬指標對應臨床嚴重肝損傷的響應為Grade 3 ALT升高(5-10x ULN)，且不伴隨膽紅素的升高。通過多重線性回歸分析發現SimPops中的體重是PF-04895162體內暴露的協變量；此外膽汁酸微管外排能力的降低將顯著影響血漿中ALT的水平。
DILIsym模擬的血漿ALT水平峰值時間(下圖7)和臨床結果也較為一致：臨床試驗中，受試者的ALT水平峰值時間分布于6.2到21天(大部分介于14到19天)，平均時間為16天；人SimPops的模擬結果分布于7.7到16.8天，平均時間為14.2天。
3.4 人體肝毒性的機理探討
進一步機制性地研究了人體模型的ATP和膽酸鹽的動力學，發現與大鼠結果相比，肝臟ATP的水平呈現顯著地下降、膽汁酸CDCA-amide也顯著上升。結果見下圖8所示：
此外還選擇了小樣本量的SimCohort (n=16)，考察ETC抑制或膽汁酸轉運體抑制關閉的情況下，對肝毒性預測結果的影響，以具體分析造成人肝毒性的主要機制，結果見表4。比較有趣的是，當去除PF-04895162介導的ETC抑制或轉運體抑制兩者中的一個機制，模擬結果都無法展現ALT水平的升高。這些研究表明，PF-04895162在抑制ETC的同時，也抑制BSEP，從而共同產生肝臟毒性(即使化合物對BSEP的親和力較弱，IC50=311 μmol/L)。
4 模型討論
肝臟暴露對毒性的影響：肝臟的藥物暴露量會影響肝毒性的預測結果，當前模型預測的人體肝臟暴露高于大鼠。雖然采用了不同的數據對大鼠及人肝臟暴露進行了驗證，但似乎也可能人體肝臟實際暴露會低于模型預測結果(導致人體模型肝毒性的結果出現假陽性)，此種情況存在可能性但又無法真實獲知。由于存在大鼠體外肝細胞內的濃度數據，因此搭建了大鼠的PBPK模型(同時吻合觀測血漿及肝細胞內的濃度，肝細胞內濃度高于體內QWBA的數值)，并基于此模型考察了大鼠肝臟濃度(高估)以及肝毒性的情況，結果發現該化合物依然對大鼠沒有明顯的肝毒性。
人體低劑量給藥后，未發現肝毒性：模型也考察了200 mg BID，共7天給藥的肝毒性情況(一個24個受試者的小臨床試驗采用了該給藥方案，且未觀察到ALT超過3x ULN)，人體SimPops的結果提示絕大部分(283/285)都無肝毒性特征，且兩個個體的ALT超過了3x ULN。此外，170 mg BID，共7天給藥的模擬結果，發現無任何個體的ALT大于3x ULN。這些模擬的結果與臨床觀測現象基本一致，同時也說明了該化合物劑量依賴性的肝毒性特征。
模型表明ALT有滯后現象，這反映PF-04895162介導膽汁酸轉運體抑制后，初始不能有效積累膽汁酸以引起毒性。此外，模擬還發現在不加入自適應免疫響應時，PF-04895162給藥后將近2周才達到ALT水平的峰值。這些滯后的毒性說明PF-04895162可能表現為固有型肝損傷。
模型雖然能重現PF-04895162種屬差異性的肝損傷，以及肝毒性的滯后現象，但ALT變化比例、升高的數值等也有觀測結果有部分差異。除了當前模型已排除的一些機理，也可能存在部分DILIsym未納入的機理；此外對比的觀測數據來自樣本量較少(n=8)小臨床試驗；同時當前的模型也未添加自適應免疫響應(體外缺少定量表征該機理的數據)；最后當前的模擬也未考慮臨床監測的情況：不管是否出現了肝損傷的信號，模型都將繼續運行直到肝細胞的損失量超過80%以上。
5 總結
該工作采用PK數據和考察肝毒性機理的體外數據，重現了PF-04895162種屬差異性的肝毒性結果，包括表征ALT水平升高的滯后現象。機制性的模型說明該化合物抑制膽汁酸轉運體引起細胞內膽汁酸的積累，進而誘導線粒體的毒性；此外還連同了ETC抑制破壞線粒體的功能(兩者共同作用，其中一個都無法造成ALT水平的變化)。該工作也為后續類似的案例模擬提供了研究基礎，通過DILIsym軟件這種QST的機制性模型可以很好地評估藥物肝毒性的特征。
6 應用軟件與模塊
該案例應用的軟件是DILIsym (v8A)，并基于此版本設定大鼠和人體人群(SimPops)的參數。
關于DILIsym軟件
DILIsym是基于定量系統毒理學的計算機模型軟件，運用微分方程來概括藥物可能導致肝損傷的關鍵過程，通過改變參數來創建模擬的患者群體或動物，以反映遺傳和非遺傳性變異，現已廣泛用于評估藥物性肝損傷的特性。軟件整合多個子模型(如肝細胞生命周期、線粒體功能損傷和毒性、膽汁酸的處置、生物標記物的釋放等)到模擬過程中。此外，DILIsym還引入了生理藥代動力學(PBPK)模型以表征藥物的代謝與處置過程，反映體內暴露情況。DILIsym軟件是由DILI-sim Initiative開發出來的，該群體是一個開放性、民辦合作組織，匯集了學術、制藥企業及US FDA等業內的科學家。DILIsym已經在多個上市前及上市藥物中進行了測試，其在80%以上的預測病例中都是準確的。
參考文獻
Grant Generaux, Vinal V. Lakhani, Yuching Yang, et al., Quantitative systems toxicology (QST) reproduces species differences in PF‐04895162 liver safety due to combined mitochondrial and bile acid toxicity. Pharmacol Res Perspect. 2019 Oct 9; 7(6): e00523. IF=2.052
延伸閱讀
1. 視頻 | 采用DILIsym軟件評估藥物性肝損傷DILI